PCR-ELISA法診斷禽流感
PCR-ELISA是將一步RT-PCR技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附法相結(jié)合，檢測病毒的一項(xiàng)診斷技術(shù)。PCR的一對(duì)引物中，其中一個(gè)用生物素標(biāo)記、另一個(gè)用地高辛標(biāo)記，在酶標(biāo)微孔板上用親和素包被，PCR擴(kuò)增后純化片段加入微孔板中。此時(shí)，微孔板上包被的親和素將與生物素標(biāo)記引物上的生物素特異性結(jié)合而捕捉了PCR片段，然后在微IL板中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，該抗體將與地高辛標(biāo)記引物上的地高辛結(jié)合，從而形成親和素-生物素-PCR片段-地高辛-地高辛抗體-辣根過氧化物酶復(fù)合物。加入酶的相應(yīng)底物進(jìn)行顯色，便可判斷PCR擴(kuò)增的有無。由于該方法是PCR和ELISA技術(shù)的結(jié)合，所以它是一種兩級(jí)放大系統(tǒng)、靈敏度更高。同時(shí)這種方法避免了PCR產(chǎn)物分析時(shí)，電泳的電極及染色過程，所以更為快捷、簡便和靈敏。丹麥學(xué)者M(jìn)Munch等建立的RT-PCR-ELISA方法，比常規(guī)RT-PCR敏感10～100倍，1個(gè)毒株（EID50＝10-84）的感染性尿囊液經(jīng)10-7稀釋仍能檢出，與雞胚病毒分離的敏感性一致。
PCR-ELISA法診斷禽流感
國內(nèi)亢文華等針對(duì)高致病性禽流感H5亞型病毒的包含多堿性氨基酸裂解位點(diǎn)特異性片斷，設(shè)計(jì)用生物素和地高辛標(biāo)記的特異性引物，從活禽咽拭子、肛拭子、糞便及病死禽組織病料中擴(kuò)增標(biāo)記RT-PCR產(chǎn)物，再以ELISA方法，用生物親和素包被的微量板孔中雜交捕獲RT-PCR產(chǎn)物·，再在微孔板中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，該抗體將與另一引物上的地高辛結(jié)合，從而形成生物親和素-生物素-PCR片段-地高辛-抗地高辛抗體-酶的復(fù)合物。加入酶的相應(yīng)底物進(jìn)行顯色，便可判斷PCR擴(kuò)增的有無。由于該方法是PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)的結(jié)合，所以它是一種兩級(jí)放大系統(tǒng)，即PCR放大和ELISA放大，試驗(yàn)證實(shí)它的靈敏度已經(jīng)超過雞胚分離法（熒光PCR檢出的zui低稀釋度為10-6.67，雞胚分離檢出的zui低稀釋度為10-7.67，PCR-ELtSA檢出的zui低稀釋度為10-8.8），證明本方法具有較高的敏感性，比普通PCR和熒光PCR更為快捷、簡便、靈敏，同時(shí)這種方法避免了PCR產(chǎn)物分析時(shí)的電泳及染色過程。
PCR-ELISA法診斷禽流感