牛血清的質(zhì)量要求

 （一）、WHO公布的《用動物細胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求：

1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

2.有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

3.證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

4.血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

5.無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。

6.對細胞有良好的支持繁殖作用。

（二）、我國在對牛血清的質(zhì)量2000年版《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質(zhì)含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內(nèi)毒素，支持細胞增殖檢查。

（三）、美國對牛血清的質(zhì)量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美國牛血清供應商的牛血清都已進入到我國市場，他們對其質(zhì)量標準要求都極為嚴格，從血清來源到產(chǎn)品質(zhì)量都有明確規(guī)定。

1） 血清來源：可從世界各國收集胎牛血清，但是必須符合他的質(zhì)量標準和美國農(nóng)業(yè)部進口要求。地方當局還不清楚本地是否有牛海綿狀病毒流行的血清不收集，有說明血清質(zhì)量的證明資料：包括收集過程的全部資料、檢驗結果和交付情況。

2）血清的收集：胎牛血清是心臟穿刺取血，新生牛（10～14天）和小牛（10個月內(nèi)）血清靜脈取血。血清采集條件必須符合工業(yè)生產(chǎn)的標準：低溫下采集、一次分離、分離后立即混合凍存。符合要求的血清56℃水浴30分鐘滅活。

3）血清的制備：

a. 超低IgG胎牛血清：通過親和層析工藝去除胎牛血清中的γ球蛋白，使FBS γ球蛋白含量減到zui低，一般IgG≤5ug/ml，生物學活性不變。

b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量＜0.5mg/ml（用葡萄糖氧化酶／過氧化酶方法測定）。

c. γ－射線照射：已經(jīng)證明γ－射線照射可以有效滅活血清中可能污染的病毒、支原體。照射劑量為30～45KG。而且這個劑量的γ－射線照射不會改變血清的理化性質(zhì)和對細胞培養(yǎng)的影響。

4）除菌過濾:經(jīng)過上述處理的粗制血清再經(jīng)過一系列除菌濾膜過濾包括0.2微米（micron）和0.1微米濾膜。FBS要通過三層0.1微米濾膜，其他血清可通過0.2微米濾膜。

4.終產(chǎn)品血清質(zhì)量

1）化學檢定：滲透壓

pH

蛋白含量――電泳法

白蛋白 球蛋白 血紅蛋白

隨著牛年齡增加血清中總蛋白含量相應增加，總的血清蛋白含量可以確定產(chǎn)品規(guī)格和年齡。

2） 微生物學檢查：細菌、真菌符合USP標準。

支原體：在支原體專業(yè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3～4周，培養(yǎng)溫度36℃±2℃分別在需氧和厭氧條件下進行，有的還需要在支原體瓊脂培養(yǎng)皿上傳4次，Hoechst熒光素DNA染色檢查那些培養(yǎng)法無法檢出的支原體如豬鼻支原體等。

病毒檢查：

牛蘭舌病毒 Bovin blue tongue

牛腺病毒 Bovine Adenovirus

牛細小病毒 Bovine Parvovirus

牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus

狂犬病病毒 Rabies

呼腸弧病毒 Reovirus

牛呼吸道合胞病毒 BRSV

副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza

檢查方法：

已證明無外源因子污染的牛細胞培養(yǎng)物，在細胞生長液中加15％待測血清，連傳3代共21天。陰性對照細胞培養(yǎng)液中加15％已知無病毒污染的牛血清，與試驗組同條件下進行。在觀察期內(nèi)注意細胞形態(tài)變化或細胞病變。在觀察期內(nèi)第14天待檢樣品和對照樣品用標準病毒檢測方法檢查。

如待檢細胞培養(yǎng)物經(jīng)胰酶消化后分種到6個含蓋玻片的容器內(nèi)。陰性對照樣品按同樣方法。再將牛腹泄病毒、牛細小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸弧病毒分別加入待檢培養(yǎng)物蓋玻片容器內(nèi)作為陽性對照，再培養(yǎng)7天，用熒光抗體技術進行檢查。

細胞病變或病毒引起的其他改變通過蘇木精或伊紅染色進行觀察。取另外一個待檢細胞培養(yǎng)瓶用人“O”紅細胞、豚鼠紅細胞和新鮮雞紅細胞作血球吸附病毒檢查。試驗在2～8℃和20～24℃進行。陰性對照細胞預先感染副流感Ⅲ型病毒作為陽性對照。未感染的細胞作為陰性對照。

3）內(nèi)毒素檢測

用鱟試劑檢查。

4）細菌噬菌體檢查

主要檢查E.Coli（C300 or K-12）噬菌體。

5）激素含量測定

每批FBS對某些激素含量都要進行測定，包括：雌二醇、胰島素、孕硐、睪丸素、甲狀腺素等。

6）血紅蛋白檢測

血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比≥70％，血紅蛋白含量≤mg15/dl。

7）細胞生長效果測定

a.細胞克隆效果測定

細胞選擇：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653

血清濃度與細胞數(shù):

10％血清／1個細胞／孔

4％血清／5個細胞／孔

細胞培養(yǎng)基RPMI－1640， 96孔培養(yǎng)盤36℃±2℃，5％二氧化碳培養(yǎng)10～15天。試驗中選擇一個已知參考牛血清作對照。

克隆效率計算：

克隆效率＝（陽性孔平均數(shù)/ 培養(yǎng)孔總數(shù)） X100％

相對克隆效率＝待測血清克隆效率/參考血清克隆效率

b.貼壁效率試驗：

用人的傳代細胞作每批血清的貼壁效率試驗，A549（人肺癌細胞）該細胞可以反應出低濃度血清的貼壁變化。采用6孔培養(yǎng)盤每批血清用兩種濃度和兩種不同的細胞接種數(shù)即10％血清――100細胞／孔，4％血清200介細胞／孔。放36℃±2℃，濕潤5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14天，計算著色細胞克隆，確定貼壁效率。從這兩種不同血清濃度來確立實驗血清支持細胞貼壁生長的水平，分析兩種試驗條件下平均貼壁效率。

貼壁效率（％）＝（每孔克隆平均數(shù)/ 每孔活存的培養(yǎng)細胞平均數(shù)） X100％

相對貼壁效率＝被測血清貼壁效率/參考血清貼壁效率